Testiranje na prisustvo antitela na SARS-CoV-2

Leave a Comment / Klinički i terapijski aspekti / 18/12/2021
POČETNA

Autor: dr med. spec. Miroslav Tomović, specijalista kliničke biohemije

Skoro sve imunokompetentne osobe razvijaju adaptivni imunski odgovor nakon infekcije SARS-CoV-2 virusom, uključujući stvaranje B i T ćelijskog imuniteta (1,2,3) usled antivirusnog humoralnog i ćelijskog odgovora, respektivno. Naše razumevanje imunskog odgovora na SARS-CoV-2 ubrzano napreduje. Infekcija koronavirusom tip 2, izazivačem teškog oblika akutnog respiratornog sindroma (SARS-CoV-2), pokreće humoralni i ćelijski posredovan imunski odgovor. Humoralni imunski odgovor se zasniva na stvaranju specifičnih antitela protiv virusnih antigena kao što su nukleokapsidni (N) i najčešće opisivani spike (šiljasti, S) protein. 

Do sada je otkriveno da S protein sadrži dve podjedinice, S1 i S2. S1 podjednica sadrži tzv. domen za vezivanje virusa na receptor ciljane ćelije domaćina (engl. receptor binding domain, RBD). Taj deo virusa predstavlja glavnu metu za vezivanje antitela. U kliničko-biohemijskom laboratorijskom radu primenjuju se testovi kojima se određuje prisustvo antitela upravo na S1 podjedinicu (anti-S1 antitela) u serumu u roku od nekoliko dana do nedelja nakon akutne infekcije SARS-CoV-2 virusom. Međutim, testiranje na antitela ne bi trebalo da se koristi za potvrdu dijagnoze akutne infekcije SARS-CoV-2 virusom, iako su se prethodni protokoli za dijagnostikovanje i lečenje COVID-19 bazirali, izmedju ostalog i na određivanju ovih antitela. Rezultati takvih testova su korišćeni kao ulazni kriterijum za hospitalizaciju non-COVID-19 bolesnika, što je umnogome omogućilo ulazak pozitivnih pacijenata u tzv. zelene zone i zaražavanje bolesnika, ali i bolničkog osoblja (verzija II protokola). 

Testovi na antitela su korisni kada je potrebno da se identifikuju osobe sa prethodnom infekcijom SARS-CoV-2 virusa i na taj način pomogne ekspertima u oblasti javnog zdravlja da bolje shvate epidemiološke karakteristike COVID-19. Iako još uvek nije ispitana povezanost količine stvorenih (samim tim i merenih) antitela na stepen zaštite od virusa, dokazi upućuju na to da antitela koje organizam stvara nakon infekcije verovatno daju određeni stepen zaštite od ponovne infekcije tokom najmanje pet do šest meseci (4,5). Međutim, nije poznato u kojoj meri bi stvorena antitela nakon prethodne infekcije mogla da utiču na zaštitu od ponovne infekcije uzrokovane različitim varijantama virusa (6).

Razvoj antitela i imunitet

Antitela klase IgM, IgG i IgA na S virusni antigen (anti-S antitela) mogu se otkriti u serumu zaražene osobe u roku od 1 do 3 nedelje nakon infekcije (7,8). Prilikom stvaranja antitela, najpre nastaju ona iz klase IgM, pa nakon toga iz klase IgG, mada su opisani i slučajevi istovremenog nastanka obe klase antitela (7). Zapaža se da antitela klase IgM (i IgA) propadaju brže od antitela klase IgG (7-9). Iako nije poznat klinički značaj merenja antitela klase IgA u serumu, kod infekcije SARS-CoV-2 virusom, pokazano je da ova klasa antitela ima važnu ulogu u zaštiti mukoznih epitelijalnih struktura od patogena procesom neutralizacije respiratornih virusa (uključujući i SARS-CoV-2) (10). 

Sa druge strane, sada je poznato da antitela klase IgG na S i N virusni antigen perzistiraju najmanje nekoliko meseci kod većine osoba (11). Kod osoba sa blagom ili asimptomatskom bolešću, uočen je gubitak antitela na SARS-CoV-2 koji se ranije detektovao (12) u vrlo kratkom vremenskom periodu. Ovaj podatak pokrenuo je naučna istraživanja sa ciljem da se utvrdi korelacija odnosno povezanost težine bolesti sa vremenom održavanja specifičnih antitela. Rezultati mnogih studija su ukazivali na to da osobe sa težim oblikom bolesti razvijaju snažniji imunski odgovor stvaranjem antitela klase IgM, IgG i IgA, pri čemu svi postižu veće titre i pokazuju dužu perzistenciju (12,13). Uočena perzistencija antitela može da varira od testa do testa, a pojedine studije su otkrile da oko 5-10% zaraženih uopšte ne razviju antitela klase IgG nakon infekcije (14,15). Iako se može desiti da se antitela ne otkriju kod pacijenata sa blagom ili asimptomatskom formom bolesti, izgleda da humoralni imunski odgovor, čak i sa gubitkom specifičnih antitela ostaje netaknut zbog postojanja memorijskih B-ćelija (16). U laboratorijskoj medicini dostupna antitela koja neutrališu SARS-CoV-2 inhibicijom replikacije virusa u in vitro uslovima (eksperimentalno) uglavnom ciljaju na deo virusa koji je odgovoran za njegovo vezivanje na ciljanu čeliju domaćina, RBD. Međutim, da bi se razumela kinetika i dinamika antitela, kao i trajanje imunske zaštite nakon preležane bolesti, te korelacija titra antitela sa stanjem imunske zaštite, neophodna je šira dostupnost kvantitativnih testova. Štaviše, testovi moraju da ispune uslove standardizacije i sledljivosti prema međunarodnom standardu (17).

Izvor slike

Pregled laboratorijskih testova i strategija testiranja

U periodu od 12. aprila 2021. do danas, na osnovu podataka Centra za saradnju i jačanje laboratorija i evaluaciju dijagnostičke tehnologije Fondacije za inovativnu dijagnostiku (FIND), u svetu je registrovano najmanje 655 imunohemijskih testova za detekciju antitela koji su ili komercijalno dostupni ili su u razvoju. 

Interni vodiči za sprovođenje analize antitela postavili su osnovne kriterijume i ciljeve testiranja, a ona podrazumevaju:

  • Primenu testiranja u epidemiološkom nadzoru i proceni imunizacionog statusa stanovništva (18);
  • Pomoć u pojačavanju dijagnostičke senzitivnosti za COVID-19 u situacijama nejasne dijagnoze kada se dobijaju negativni dijagnostički testovi uz klinički relevantan dokaz prisustva bolesti (neadekvatno testiranje, lažno negativni rezultati i sl) (19-21);
  • Selekciju hiperimune plazme u toku lečenja COVID-19 bolesnika primenom plazme rekonvalescenata (22,23);
  • Procenu imunskog odgovora i trajnosti vakcina protiv COVID-19 (24,25). Što se tiče primene vakcina, pojedini autori ističu korisnost testova na antitela kao veoma isplativog načina za sprovođenje strategije vakcinacije sa ciljem unapređenja javnog zdravlja (26). Iako ova nova uloga još uvek nije u potpunosti naučno potvrđena, pošto ne znamo koliko dugo trajna antitela pružaju zaštitu, sve je jasnije da su testovi na antitela potrebni za praćenje i proveru odgovora na vakcine kako bi se podržalo tumačenje kliničkih ishoda. 

Testiranje na antitela se ne preporučuje za:

  • Procenu imuniteta na COVID-19 nakon vakcinacije;
  • Procenu potrebe za vakcinacijom kod nevakcinisane osobe;
  • Utvrđivanje potrebe za karantinom nakon bliskog kontakta sa nekim ko ima potvrdjen slučaj COVID-19.

Laboratorijski testovi dizajnirani da detektuju antitela određene klase imunoglobulina protiv SARS-CoV-2 su laki za implementaciju u poređenju sa testovima kojima se detektuje ćelijski imunski odgovor. Stoga se ti testovi vrlo lako mogu primeniti u velikim razmerama kroz komercijalne i referentne laboratorije. Pored toga,  podložni su standardizaciji kroz programe kontrole kvaliteta (regulatorni principi usklađenosti). 

Trenutno dostupni testovi u Srbiji, koje registruje odgovarajuće regulatorno telo – Agencija za lekove i medicinska sredstva (ALIMS), određuju antitela klase IgM i/ili IgG ili ukupna antitela (IgG, IgM i IgA) na S protein, N protein ili S1 region (RBD) virusnog antigena. Grupišu se u nekoliko opštih kategorija: 

  • brzi testovi, 
  • enzimski imunosorbentni testovi (engl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 
  • fluorescentni enzimski testovi (engl. Enzyme-linked fluorescent assay, ELFA), 
  • hemiluminiscentni (engl. chemiluminiscent immunoassay, CLIA) i 
  • elektrohemiluminiscentni (engl. Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA). 

Jasno je da se detekcija antitela zasniva na primeni različitih tehnologija određivanja. U odnosu na princip testiranja, grupišu se u tri kategorije: 

  • kvalitativni, 
  • polu-kvantitativni i 
  • kvantitativni testovi. 

Međutim, svi testovi koji se pojavljuju na tržištu Republike Srbije (registrovani od strane ALIMS-a) preporučuju se u kliničke i javnozdravstvene svrhe. Najveći broj dostupnih komercijalnih testova u našoj zemlji su u kategoriji kvalitativnih testova, koje određuju prisustvo (i/ili odsustvo) specifičnih antitela klase IgM i/ili IgG na dati virusni antigen. Značajan broj komercijalnih testova su iz grupe polu-kvantitativnih testova (engl. semi-quantitative) koji, pored toga što određuju prisustvo ili odsustvo antitela, pokazuju i numeričku vrednost. Oni ne pružaju informaciju o preciznoj količini antitela već isključivo daju procenu količine proizvedenih antitela na virusne antigene pa se, često pogrešno, te vrednosti interpretiraju kao titar antitela. Naime, polu-kvantitativni testovi, pružaju rezultat koji se kalibriše korišćenjem granične vrednosti signala na osnovu prosečnog intenziteta signala pozitivnih i negativnih kontrola, čime se postavlja prag seropozitivnosti. Na kraju, kvantitativni testovi izražavaju količinu stvorenih antitela na dati antigen i izmerena vrednost se izražava u jedinicama mere. 

Za određivanje različitih aspekata adaptivnog imunskog odgovora i funkcionalnosti antitela mogu se koristiti različite vrste testova. Oni se mogu široko klasifikovati da bi se otkrila ili vezujuća ili neutrališuća priroda antitela (27). 

 
Testovi detekcije vezujućih antitela (engl. Binding antibody detection)

Ovi   testovi koriste prečišćene proteine SARS-CoV-2 virusa i mogu se izvesti u laboratorijama nižeg nivoa biološke bezbednosti (BSL-2). Sa specifičnim reagensima, mogu se klasifikovati pojedinačni tipovi antitela, kao što su IgG, IgM i IgA. I antitela na SARS-CoV-2 klase IgG i IgM mogu se otkriti otprilike u isto vreme nakon infekcije. Međutim, dok je IgM najkorisniji za određivanje nedavne infekcije, obično postaje neotkriven nedeljama do mesecima nakon infekcije. Sa druge strane, IgG se obično može detektovati tokom dužeg perioda. IgA je važan za imunitet sluzokože i može se otkriti u mukoznim sekretima poput pljuvačke, mada njen značaj u ovoj bolesti tek treba da se utvrdi. U zavisnosti od njihove složenosti, neki testovi se mogu izvršiti brzo (za svega 30 minuta) na terenu ili za par sati u laboratorijama. Testovi koji detektuju vezujuća antitela mogu se grupisati u sledeće kategorije:

  1. Point of care (POCT) testovi – dijagnostički testovi koji se izvode na ili blizu mesta gde se uzorak uzima i mogu dati rezultate u roku od nekoliko minuta. Radi se o brzim testovima čiji je princip određivanja antitela metodom lateralne protočne imunoesej hromatografije (imunohromatografije) i dostupni su u obliku specijalnih kaseta (slično brzim testovima na trudnoću). Test se zasniva na razdvajanju komponenti smeše kroz medijum korišćenjem kapilarne sile i specifičnog i brzog vezivanja antitela za specifični antigen virusa. Detektuju prisustvo IgM i/ili IgG klase antitela iz pune krvi, kapilarne krvi (iz prsta). Rezultati se izražavaju kvalitativno kao: pozitivan ili negativan odnosno reaktivan ili nereaktivan.

Izvor slike

2. Laboratorijski testovi koriste gore pomenute  ELISA, CLIA, ELFA i ECLIA tehnologiju za detekciju antitela u serumu, plazmi, punoj krvi ili osušenim krvnim mrljama (izrazito retko), što za neke testove može zahtevati obučeno laboratorijsko osoblje i specijalne laboratorijske instrumente odnosno analizatore. Na osnovu testa mogu se otkriti ukupna antitela (IgM, IgG i IgA) ili pojedinačna antitela na dati virusni antigen. Dok većina testova otkriva antitela protiv S ili N virusnih antigena, pojedini testovi mogu otkriti antitela protiv oba imunodominantna proteina (multipleks testovi). Testovi poslednje generacije određenih proizvođača, pak, detektuju i kvantifikuju antitela na S1 podjedinicu ili RBD. Rezultati se izražavaju u internacionalnim jedinicama po mililitru (IU/mL), tzv. arbitrarnim jedinicama po mililitru (AU/mL) ili jedinice vezujućih antitela po mililitru (engl. Binding antibody unit, BAU/mL).

Testovi detekcije neutrališućih antitela

Ovi testovi određuju funkcionalnu sposobnost antitela da spreče infekciju SARS-CoV-2 u in vitro uslovima (eksperimentalno). Ovi testovi prate inhibiciju rasta virusa u ćelijskoj kulturi kada se inkubiraju sa serumom ili plazmom. Opisano je nekoliko vrsta testova detekcije neutrališućih antitela i one, trenutno, nisu registrovane za upotrebu  u našoj zemlji.  

 

Izbor testova

Prilikom izbora testova najvažnije je utvrditi njihove performanse. Testovi za detekciju i kvantifikaciju antitela sa veoma visokom osetljivošću i specifičnošću su poželjniji, jer je veća verovatnoća da će pokazati visoke pozitivne i negativne prediktivne vrednosti kada se primenjuju oko tri nedelje od početka bolesti. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) je objavila ciljne profile medicinskih sredstava za dijagnostiku COVID-19 navodeći da su jedino prihvatljivi kriterijumi za osetljivost i specifičnost testova 95-97% i 98-99%, respektivno (28).

Pri odabiru testova na antitela, neophodno je sagledati sledeće:

  • Nivoi IgG opadaju sporije tokom vremena od nivoa drugih klasa antitela. Prema tome, testovi koji mere ukupna antitela ili pojedinačna, klase IgG mogu imati veću osetljivost kako se vreme izmedju infekcije i testiranja na antitela povećava;
  • IgM antitela mogu da opstanu nedeljama do mesecima nakon infekcije, iako se čini da je njihovo zadržavanje u serumu kraće od IgG. Stoga, otkrivanje IgM može ukazivati na relativno skoriju infekciju;
  • Perzistentnost detektabilnih antitela može da varira u zavisnosti od testa koji se koristi. 

 

Zaključci

  • Serološko testiranje ima javno-zdravstvenu i kliničku upotrebnu vrednost pa testove za detekciju i merenje antitela treba koristiti za praćenje i reagovanje na pandemiju COVID-19 u smislu praćenja epidemioloških karakteristika bolesti.
  • Testiranje na prisustvo antitela nije zamena za dokazivanje prisustva virusa i ne sme se koristiti za postavljanje dijagnoze akutne infekcije SARS-CoV-2 virusom.
  • Testovi na antitela mogu da variraju u svojim individualnim karakteristikama.
  • SZO, Američka uprava za hranu i lekove (engl. Food and drug administration, FDA) i njihova dozvola za hitnu upotrebu leka (engl. Emergency use authorization, EUA) nisu postavile standarde u metodologiji određivanja antitela, pa ne postoji referentna metoda određivanja antitela. Samim tim, nije ispitano da li druge metode dobro koreliraju sa referentnom metodom. Iz tog razloga, upozorava se da se određeni rezultati dobijeni u jednoj laboratoriji jednom određenom metodom analize, ne mogu porediti sa rezultatom druge laboratorije iz istog uzorka.
  • Testovi neutralizacije zasnovani na virusima trenutno nisu odobreni za upotrebu od strane FDA i EUA. Takođe, nisu odobreni ni u našoj zemlji od strane ALIMS-a i  koriste se, za sada, u epidemiološkim i kliničkim studijama.
  • Najveći broj proizvođača testova na antitela registrovanih u Srbiji naglašavaju da nije utvrđen klinički značaj pozitivnog ili negativnog rezultata nakon vakcinacije, pa rezultate ne treba tumačiti kao stepen zaštićenosti od infekcije i/ili re-infekcije nakon vakcinacije. Testovi su dizajnirani tako da detektuju ili mere antitela stvorena nakon preležane infekcije u bilo kom obliku. 
  • Visoke vrednosti antitela ne ukazuju na bolji imunski odgovor nakon vakcinacije. Nije dokazana korelacija količine stvorenih antitela sa funkcionalnim imunskim odgovorom. Kliničke studije korelacije su u toku. Iz tog razloga, dobijene vrednosti na rezultatu testiranja ne mogu biti kriterijum odlučivanja da li primeniti vakcinu ili ne.
  • Numeričke vrednosti na izveštaju rezultata nikako ne uzimati kao meru adekvatnog imunskog odgovora posebno ako se pri testiranju koriste semi-kvantitativni testovi.
  • Sve osobe koje ispunjavaju uslove treba da budu vakcinisane, uključujući i nevakcinisane osobe koje su prehodno bile zaražene i imaju antitela koja se mogu detektovati. 

 

Reference

  1. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, Mateus J, Dan JM, Moderbacher CR, et al. Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell. 2020;181(7):1489-501 e15.
  2. Robbiani DF, Gaebler C, Muecksch F, Lorenzi JCC, Wang Z, Cho A, et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 2020;584(7821):437-42.
  3. Suthar MS, Zimmerman MG, Kauffman RC, Mantus G, Linderman SL, Hudson WH, et al. Rapid generation of neutralizing antibody responses in COVID-19 patients. Cell Rep Med. 2020;1(3):100040.
  4. Hall VJ, Foulkes S, Charlett A, Atti A, Monk EJM, Simmons R, et al. SARS-CoV-2 infection rates of antibody-positive compared with antibody-negative health-care workers in England: a large, multicentre, prospective cohort study (SIREN). Lancet. 2021;397(10283):1459-69.
  5. Lumley SF, O’Donnell D, Stoesser NE, Matthews PC, Howarth A, Hatch SB, et al. Antibody status and incidence of SARS-CoV-2 infection in health care workers. N Engl J Med. 2020;384:533-40.
  6. Abdool Karim SS, de Oliveira T. New SARS-CoV-2 Variants – Clinical, Public Health, and Vaccine Implications. N Engl J Med. 2021;384(19):1866-8.
  7. Qu J, Wu C, Li X, Zhang G, Jiang Z, Li X, et al. Profile of immunoglobulin G and IgM antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Clin Infect Dis. 2020;71(16):2255-8.
  8. Wolfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S, Muller MA, et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 2020;581(7809):465-9.
  9. Iyer AS, Jones FK, Nodoushani A, Kelly M, Becker M, Slater D, et al. Persistence and decay of human antibody responses to the receptor binding domain of SARS-CoV-2 spike protein in COVID-19 patients. Sci Immunol. 2020;5(52).
  10. Matuchansky C. Mucosal immunity to SARS-CoV-2: a clinically relevant key to deciphering natural and vaccine-induced defences. Clin Microbiol Infect. 2021;27(12):1724-1726.
  11. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Faliti CE, Ramirez SI, et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for greater than six months after infection. bioRxiv. 2020(10.1101/2020.11.15.383323).
  12. Milani GP, Dioni L, Favero C, Cantone L, Macchi C, Delbue S, et al. Serological follow-up of SARS-CoV-2 asymptomatic subjects. Sci Rep. 2020;10(1):20048.
  13. Rijkers G, Murk JL, Wintermans B, van Looy B, van den Berge M, Veenemans J, et al. Differences in antibody kinetics and functionality between severe and mild severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infections. J Infect Dis. 2020;222(8):1265-9.
  14. Petersen LR, Sami S, Vuong N, Pathela P, Weiss D, Morgenthau BM, et al. Lack of antibodies to SARS-CoV-2 in a large cohort of previously infected persons. Clin Infect Dis. 2020;73(9):e3066-e3073.
  15. Kaufman HW, Chen Z, Meyer WA, 3rd, Wohlgemuth JG. Insights from patterns of SARS-CoV-2 immunoglobulin G serology test results from a national clinical laboratory, United States, March-July 2020. Popul Health Manag. 2020;24(S1):S35-S42.
  16. Ogega CO, Skinner NE, Blair PW, Park HS, Littlefield K, Ganesan A, et al. Durable SARS-CoV-2 B cell immunity after mild or severe disease. J Clin Invest. 2021;131(7).
  17. Gundlapalli AV, Reynolds MS, Brooks JT, Francisco A, Petersen L, McDonald LC, et al. SARS-CoV-2 serologic assay needs for the next phase of U.S. COVID-19 pandemic response. Open Forum Infecti Dis. 2020;8:ofaa555.
  18. Eckerle I., Meyer B. SARS-CoV-2 seroprevalence in COVID-19 hotspots. Lancet. 2020;396:514–515. 
  19. Zhao J., Yuan Q., Wang H., Liu W., Liao X., Su Y. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis. 2020;71:2027–2034. 
  20. Guo L., Ren L., Yang S., Xiao M., Chang D., Yang F. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19) Clin Infect Dis. 2020;71:778–785. 
  21. Carter L.J., Garner L.V., Smoot J.W., Li Y., Zhou Q., Saveson C.J. Assay Techniques and Test Development for COVID-19 Diagnosis. ACS Cent Sci. 2020;6:591–605. 
  22. Ni L., Ye F., Cheng M.L., Feng Y., Deng Y.Q., Zhao H. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals. Immunity. 2020;52:971–977.e3. 
  23. Shen C., Wang Z., Zhao F., Yang Y., Li J., Yuan J. Treatment of 5 Critically Ill Patients With COVID-19 With Convalescent Plasma. JAMA. 2020;323:1582–1589. 
  24. Jeyanathan M., Afkhami S., Smaill F., Miller M.S., Lichty B.D., Xing Z. Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies. Nat Rev Immunol. 2020;20:615–632. 
  25. Samrat S.K., Tharappel A.M., Li Z., Li H. Prospect of SARS-CoV-2 spike protein: Potential role in vaccine and therapeutic development. Virus Res. 2020;288 
  26. Gudbjartsson D.F., Norddahl G.L., Melsted P., Gunnarsdottir K., Holm H., Eythorsson E. Humoral Immune Response to SARS-CoV-2 in Iceland. N Engl J Med. 2020;383:1724–1734. 
  27. National Center for Immunization and Respiratory Diseases (NCIRD), Division of Viral Diseases. Interim Guidelines for COVID-19 Antibody Testing in Clinical and Public Health Settings.                                                                                 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html [Accessed 21 September 2021].
  28. World Health Organization. COVID-19 Target product profiles for priority diagnostics to support response to the COVID-19 pandemic v.0.1; 2020. Available https://www.who.int/publications/m/item/covid-19-target-product-profiles-for-priority-diagnostics-to-support-response-to-the-covid-19-pandemic-v.0.1[Accessed 29 April 2021].

Kontaktirajte nas

PODRŽITE RAD UPK

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *