Laboratorijsko testiranje na SARS-CoV-2

Rezime:

  • Test za postavljanje dijagnoze SARS-CoV-2 infekcije je PCR test kojim se utvrđuje prisustvo virusa.
  • Testovi kojima se utvrđuje prisustvo antitela (ELISA, eCLIA, brzi hromatografski testovi) ne mogu se koristiti kao jedini test za postavljanje dijagnoze COVID 19, jer se antitela ovim testovima ne mogu detektovati za vreme kraće od 7 dana od pojave simptoma, a kod blagog toka su nekad potrebne i nedelje za serokonverziju. Prisustvo antitela može da se koristi za potvrdu dijagnoze kasnije tokom bolesti i za studije seroprevalence.
  • Za postavljanje dijagnoze bi mogli da se koriste brzi hromatografski testovi kojima se detektuju antigeni virusa ukoliko bi bili visoko osetljivi i specifični. Brzi testovi koji nemaju visoku osetljivost i specifičnost ne mogu se koristiti za skrining populacije.

 

Laboratorijska dijagnostika SARS-CoV-2 infekcije

 

PCR testovi (određivanje prisustva genoma SARS-CoV-2)

Dijagnostika SARS-CoV-2 infekcije se zasniva na testiranju umnožavanjem nukleinske kiseline virusa  -PCR (engl. polymerase chain reaction) testu (1). Kako je SARS-CoV-2 RNK virus, PCR testu prethodi korak reverzne transkripcije kojim se RNK prevodi u DNK , što se obično obavlja U PCR testovima koji su kod nas zastupljeni detektuju se sekvence za 1 do 3 virusna gena, zavisno od proizvođača testa. Proizvođač svakog testa daje uputstvo za tumačenje kada je test pozitivan, negativan odnosno kada treba da se ponovi. U istoj reakciji se detektuje i jedan humani gen. Humana sekvenca detektovana u dovoljnoj količini je jedan od preduslova za tumačenje nalaza, jer odražava količinu ćelija koja je uzeta brisom.

Laboratorijska obrada, nakon prijema i identifikacije uzoraka, podrazumeva ekstrakciju nukleinskih kiselina ili lizu sa reagensom za oslobađanje nukleinskih kiselina, reverznu transkripciju i PCR. Osnovna prednost korišćenja reagenasa za lizu u odnosu na ekstrakciju je značajno brže dolaženje do rezultata, u odnosu na manuelnu ekstrakciju ili ekstarkciju robotizovanim sistemima sa malim brojem uzoraka (obično 12). Mana liziranja je manja stabilnost i prečišćenost lizata u odnosu na ekstrakt, jer se liziranjem ne odstranjuju inhibitori PCR-a iz uzorka i nema koncentrisanja RNK. Idelno bi bilo da se ekstrakcija vrši robotizovanim sistemima za veliki broj uzoraka (kao što se radi u laboratoriji Vatreno oko).

Najčešće korišćeni reagensi za PCR u našim laboratorijama su od proizvođača BGI Genomics (Real-Time Fluorescent RT-PCR Kit for Detecting SARS-CoV-2), SanSure Biothech (Novel Coronavirus (2019-nCoV) Nucleic Acid Diagnostic Kit), OSANG Healthcare (GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit) i a za Da An Gene (Detection Kit for 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) RNA). U Tabeli 1. je dat pregled karakteristika ovih PCR testova.

Tabela 1. Karakteristike najčešće korišćenih PCR testova u Srbiji

PCR reagensi

Reverzna transkripcija u istoj reakcionoj smeši sa PCR

PCR nakon reagensa za oslobađanje nukleinskih kiselina

Virusni gen koji se detektuje

Detekcija humanog gena (interna pozitivna kontrola)

Limit detekcije

broj kopija/mL

Unakrsna reaktivnost in silico (broj ispitivanih respiratornih patogena)

Unakrsna reaktivnost (broj ispitivanih respiratornih patogena)

BGI

Da

Ne

ORF1ab

Da

100 (BALF)

150 (bris ždrela)

/

Ne (54)

SanSure

Da

Da

Orf 1ab

N gen

Da

200 (bris ždrela)

Ne (27)

Ne (23+nazalni ispirak)

GeneFinder

Da

Ne

RdRp

E gen

N gen

Da

500 (sputum i bris ždrela)

Ne (18)

Ne(20)

Da An

Da

Da

Orf 1ab

N gen

Da

500 (sputum i bris ždrela)

Ne (33)*


*Nije navedeno da li je unakrsna reaktivnost testirana
in silico ili u uzorcima

Najčešće korišćeni testovi detektuju 1-3 virusne sekvence i 1 humanu sekvencu koja predstavlja internu pozitivnu kontrolu svakog uzorka. Za mali broj uzoraka (oko 200) je upotrebljen test (Vector) koji ne umnožava i humanu sekvencu, a zbog ovog i drugih nedostataka (reverzna transkripcija Vector reagensima je poseban korak, što produžava vreme obrade i povećava mogućnost kroskontaminacije, a i niža osetljivost PCR testa) se nije dalje koristio. Nijedan protokol sem Vector reagenasa nije imao reverznu transkripciju kao poseban korak.

Proizvođači svih PCR testova koji se kod nas koriste navode 100% specifičnost, tj. da praktično nema mogućnosti da se PCR testom za SARS-CoV-2 detektuje neki drugi respiratorni infektivni agens. Visoka specifičnost PCR testa se zasniva na tome da se oligonukleotidi kojima se detektuje ciljna sekvenca dizajniraju tako da ne mogu da se vežu ni za jednu DNK sekvencu sem ciljne. U praksi, lažna pozitivnost je moguća kod slabo pozitivnih uzoraka. Kod kasne amplifikacije tj. slabo pozitivnog PCR signala (visokih Ct vrednosti) treba biti na oprezu pri tumačenju nalaza. Testovi pojedinih proizvođača češće daju ovakve nalaze.

Moguća je lažna pozitivnost usled kontaminacije uzorka materijalom koji sadrži ciljnu sekvencu i zato treba vrlo pažljivo rukovati biološkim materijalom, počev od uzorkovanja do same analize. Brisevi, kontelneri za transport i transportni medijum takođe moraju da se čuvaju u  uslovima kojima će se sprečiti kontaminacija pre samog uzorkovanja.

S druge strane, iako je senzitivnost PCR testa takođe visoka, negativan rezulat može da bude lažno negativan u značajnom procentu slučajeva. Brojni su faktori koji utiču:

  1. Kvalitet uzorkovanja i karakteristike uzetog materijala najviše utiču na rezultat PCR testa. Osetljivost se smanjuje i do 30% ukoliko se umesto nazofaringealnog brisa uzima bris orofarinksa i/ili intranazalni bris. Na kvalitet uzorkovanja može da se utiče. Dodatno, sastav uzorka može da ometa PCR reakciju (npr. sadržaj sekreta).
  2. Nalaz virusa u uzetom materijalu zavisi od faze bolesti. Maksimalna koncentracija virusa u gornjim respiratornim putevma je u vreme pojave simptoma i postepeno opada. Virus u kasnijem toku bolesti može da se detektuje u uzorcima donjih disajnih puteva. Trajanje detektabilnosti virusne RNK varira od nekoliko dana do nekoliko nedelja i ne mora da koreliše sa kliničkom slikom i infektivnošću.
  3. Način i vreme transporta – mogućnost detekcije virusa opada tokom stajanja uzorka, pogotovo na višim temperaturama. Za transport je potreban hladan lanac.
  4. Protokol testa – Izvođenje PCR testa nakon ekstrakcije RNK nasuprot alternativnim postupcima (liza ćelija u uz reagens za oslobađanje RNK) – metoda se mora validovati; tretman toplotom radi inaktivacije virusa smanjuje kvalitet RNK.

Detaljnije o organizaciji i problemima PCR dijagnostike za COVID-19 u Srbiji piše Popadić (2).

 

Antigenski testovi (određivanje prisustva antigena SARS-CoV-2)

Dijagnostički testovi koji detektuju SARS-CoV-2 napravljeni su za direktno otkrivanje SARS-CoV-2 proteina proizvedenih replikacijom virusa u gornjim respiratornim putevima (nosni bris ili nazofarinks) i razvijeni su kao brzi dijagnostički testovi (imunohromatografski, „lateral flow“). Ciljni antigen je uglavnom nukleokapsidni (N) protein virusa. U poređenju sa PCR-om, prosečna osetljivost antigenskih testova bila je 56,2%, a prosečna specifičnost 99,5%. Testovi na antigen imaju dobar učinak kod pacijenata sa COVID19 s velikim virusnim opterećenjem (vrednosti Ct ≤25 u PCR analizi) prisutnim u presimptomatskom (1-3 dana pre pojave simptoma) i ranim simptomatskim fazama bolesti (u prvih 5 -7 dana bolesti). Pacijenti koji se jave 5-7 dana nakon pojave simptoma imaju niža virusna opterećenja i veću verovatnoću lažno negativnih rezultata u brzim testovima antigena koji ne isključuju infekciju i zahtevaju dodatno PCR testiranje.

Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji, antigenski testovi na SARS-CoV-2 koji zadovoljavaju minimalne zahteve za osetljivost od ≥80% i specifičnost od ≥ 97%, u poređenju s PCR referentnim testom mogu se koristiti za dijagnozu SARS-CoV-2 infekcije.

U ovom trenutku, od 84 antigenska testa na tržištu, samo 2 zadovoljavaju kliničku senzitivnost od preko 80% (3). Klinička senzitivnost jednog od testova (COVID-19 Ag Respi-Strip, Coris BioConcept) koji se kod nas koristi nije zadovoljio kriterijume SZO (osetljivost od ≥80% i specifičnost od ≥ 97%), jer mu je osetljivost bila u realnoj, kliničkoj primeni 50% (3). SZO jasno ograničava primenu brzih antigenskih testova na: 1) ranu simptomatsku fazu bolesti (prvih 5-7 dana od pojave simptoma), za uzorke koje propisuje proizvođač i striktno prema uputstvu proizvođača; 2) u okolnostima kada testovi detekcije nukleinske kiseline virusa nisu dostupni (PCR testiranje) ili je čekanje na rezultate prolongirano; 3) u grupama pacijenata gde se očekuje velika učestalost javljanja SARS-CoV 2 infekcije. SZO ne preporučuje korišćenje ovih testova u okolnostima kada se očekuje niska prevalenca (putnici pri prelasku granica, osobe bez simptoma koje nisu imale kontakt sa dokazano pozitivnim osobama, dobrovoljni davaoci krvi), jer je tada pozitivna prediktivna vrednost testa jako niska (u domenu statističke greške) (4).

 

Serološki testovi (određivanje prisustva antitela za SARS-CoV-2)

Serološkim testovima za SARS-CoV-2 se dokazuje prisustvo antitela na virus (IgM, IgG ili oba). Serološki testovi se zasnivaju na više tehnika. Brzi imunohromatografski („lateral flow“) test detektuje prisustvo IgM i IgG antitela bez mogućnosti kvantifikovanja. Osnovni problem je niža specifičnost ovih testova (unakrsna reaktivnost antitela sa ostalim virusima iz grupe koronavirusa). Kvantitativni testovi zasnovani na enzimskom imunoeseju (ELISA, eCLIA, itd.) su zahtevniji za izvođenje ali su i pouzdaniji. Neki od ovih testova detektuju ukupna antitela, tj. nema razlikovanja IgM i IgG.

S obzirom da je za sam humoralni imunski odgovor (sintezu antitela) potrebno vreme i da serološki testovi imaju određeni prag osetljivosti, kao i nižu specifičnost zbog unakrsne reaktivnosti sa drugim koronavirusima, serološko testiranje ne može da zameni PCR i antigenske testove u postavljanju dijagnoze u ranoj fazi bolesti. Prisustvo IgM se očekuje počev od 8. dana od pojave simptoma, a IgG počev od 10. dana, u proseku. Kod blažeg kliničkog toka i asimptomatskih pacijenata je moguće da antitela ostanu nedetektabilna, ili da se detektuju tek nakon nekoliko nedelja od pozitivnog rezultata PCR testa.

Serokonverzija u Sars-Cov-2 infekciji može da bude sinhrona, da se prvo javi IgM ili da se čak prvo javi IgG (4). Moguće je da je šarolik obrazac serokonverzije rezultat pouzdanosti samih testova. Serološki testovi se unapređuju i može da se očekuje da se nakon razvoja boljih testova dođe do drugačijih saznanja. Na osnovu prisustva antitela ne može se sa sigurnošću tvrditi da je oboleli imun na virus. Ujedno ni odsustvo antitela ne znači da imunost ne postoji, jer pored antitela i celularni imunski odgovor može obolelog da učini imunim.

Zbog svega navedenog, treba imati u vidu ograničenja seroloških testova i ne koristiti ih za inicijalno postavljanje dijagnoze COVID-19, već eventualno 1) kao potvrdni test u kasnijoj fazi infekcije i 2) u studijama seroprevalencije radi retrospektivne procene udela populacije koji je došao u kontakt s virusom. Za obe situacije preporuka je da se koristi kvantitativni test, i to za parne uzorke seruma, kako bi se na osnovu praćenja promene titra doneo pouzdan zaključak.

Leave a Comment

Your email address will not be published.