Laboratorijsko testiranje na SARS-CoV-2

Najčešće korišćeni testovi detektuju 1-3 virusne sekvence i 1 humanu sekvencu koja predstavlja internu pozitivnu kontrolu svakog uzorka. Za mali broj uzoraka (oko 200) je upotrebljen test (Vector) koji ne umnožava i humanu sekvencu, a zbog ovog i drugih nedostataka (reverzna transkripcija Vector reagensima je poseban korak, što produžava vreme obrade i povećava mogućnost kroskontaminacije, a i niža osetljivost PCR testa) se nije dalje koristio. Nijedan protokol sem Vector reagenasa nije imao reverznu transkripciju kao poseban korak.

Proizvođači svih PCR testova koji se kod nas koriste navode 100% specifičnost, tj. da praktično nema mogućnosti da se PCR testom za SARS-CoV-2 detektuje neki drugi respiratorni infektivni agens. Visoka specifičnost PCR testa se zasniva na tome da se oligonukleotidi kojima se detektuje ciljna sekvenca dizajniraju tako da ne mogu da se vežu ni za jednu DNK sekvencu sem ciljne. U praksi, lažna pozitivnost je moguća kod slabo pozitivnih uzoraka. Kod kasne amplifikacije tj. slabo pozitivnog PCR signala (visokih Ct vrednosti) treba biti na oprezu pri tumačenju nalaza. Testovi pojedinih proizvođača češće daju ovakve nalaze.

Moguća je lažna pozitivnost usled kontaminacije uzorka materijalom koji sadrži ciljnu sekvencu i zato treba vrlo pažljivo rukovati biološkim materijalom, počev od uzorkovanja do same analize. Brisevi, kontelneri za transport i transportni medijum takođe moraju da se čuvaju u  uslovima kojima će se sprečiti kontaminacija pre samog uzorkovanja.

S druge strane, iako je senzitivnost PCR testa takođe visoka, negativan rezulat može da bude lažno negativan u značajnom procentu slučajeva. Brojni su faktori koji utiču:

1. Kvalitet uzorkovanja i karakteristike uzetog materijala najviše utiču na rezultat PCR testa. Osetljivost se smanjuje i do 30% ukoliko se umesto nazofaringealnog brisa uzima bris orofarinksa i/ili intranazalni bris. Na kvalitet uzorkovanja može da se utiče. Dodatno, sastav uzorka može da ometa PCR reakciju (npr. sadržaj sekreta).
2. Nalaz virusa u uzetom materijalu zavisi od faze bolesti. Maksimalna koncentracija virusa u gornjim respiratornim putevma je u vreme pojave simptoma i postepeno opada. Virus u kasnijem toku bolesti može da se detektuje u uzorcima donjih disajnih puteva. Trajanje detektabilnosti virusne RNK varira od nekoliko dana do nekoliko nedelja i ne mora da koreliše sa kliničkom slikom i infektivnošću.
3. Način i vreme transporta – mogućnost detekcije virusa opada tokom stajanja uzorka, pogotovo na višim temperaturama. Za transport je potreban hladan lanac.
4. Protokol testa – Izvođenje PCR testa nakon ekstrakcije RNK nasuprot alternativnim postupcima (liza ćelija u uz reagens za oslobađanje RNK) – metoda se mora validovati; tretman toplotom radi inaktivacije virusa smanjuje kvalitet RNK.

Detaljnije o organizaciji i problemima PCR dijagnostike za COVID-19 u Srbiji piše Popadić (2).

Antigenski testovi (određivanje prisustva antigena SARS-CoV-2)

Dijagnostički testovi koji detektuju SARS-CoV-2 napravljeni su za direktno otkrivanje SARS-CoV-2 proteina proizvedenih replikacijom virusa u gornjim respiratornim putevima (nosni bris ili nazofarinks) i razvijeni su kao brzi dijagnostički testovi (imunohromatografski, „lateral flow“). Ciljni antigen je uglavnom nukleokapsidni (N) protein virusa. U poređenju sa PCR-om, prosečna osetljivost antigenskih testova bila je 56,2%, a prosečna specifičnost 99,5%. Testovi na antigen imaju dobar učinak kod pacijenata sa COVID19 s velikim virusnim opterećenjem (vrednosti Ct ≤25 u PCR analizi) prisutnim u presimptomatskom (1-3 dana pre pojave simptoma) i ranim simptomatskim fazama bolesti (u prvih 5 -7 dana bolesti). Pacijenti koji se jave 5-7 dana nakon pojave simptoma imaju niža virusna opterećenja i veću verovatnoću lažno negativnih rezultata u brzim testovima antigena koji ne isključuju infekciju i zahtevaju dodatno PCR testiranje.

Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji, antigenski testovi na SARS-CoV-2 koji zadovoljavaju minimalne zahteve za osetljivost od ≥80% i specifičnost od ≥ 97%, u poređenju s PCR referentnim testom mogu se koristiti za dijagnozu SARS-CoV-2 infekcije.

U ovom trenutku, od 84 antigenska testa na tržištu, samo 2 zadovoljavaju kliničku senzitivnost od preko 80% (3). Klinička senzitivnost jednog od testova (COVID-19 Ag Respi-Strip, Coris BioConcept) koji se kod nas koristi nije zadovoljio kriterijume SZO (osetljivost od ≥80% i specifičnost od ≥ 97%), jer mu je osetljivost bila u realnoj, kliničkoj primeni 50% (3). SZO jasno ograničava primenu brzih antigenskih testova na: 1) ranu simptomatsku fazu bolesti (prvih 5-7 dana od pojave simptoma), za uzorke koje propisuje proizvođač i striktno prema uputstvu proizvođača; 2) u okolnostima kada testovi detekcije nukleinske kiseline virusa nisu dostupni (PCR testiranje) ili je čekanje na rezultate prolongirano; 3) u grupama pacijenata gde se očekuje velika učestalost javljanja SARS-CoV 2 infekcije. SZO ne preporučuje korišćenje ovih testova u okolnostima kada se očekuje niska prevalenca (putnici pri prelasku granica, osobe bez simptoma koje nisu imale kontakt sa dokazano pozitivnim osobama, dobrovoljni davaoci krvi), jer je tada pozitivna prediktivna vrednost testa jako niska (u domenu statističke greške) (4).

Serološki testovi (određivanje prisustva antitela za SARS-CoV-2)

Serološkim testovima za SARS-CoV-2 se dokazuje prisustvo antitela na virus (IgM, IgG ili oba). Serološki testovi se zasnivaju na više tehnika. Brzi imunohromatografski („lateral flow“) test detektuje prisustvo IgM i IgG antitela bez mogućnosti kvantifikovanja. Osnovni problem je niža specifičnost ovih testova (unakrsna reaktivnost antitela sa ostalim virusima iz grupe koronavirusa). Kvantitativni testovi zasnovani na enzimskom imunoeseju (ELISA, eCLIA, itd.) su zahtevniji za izvođenje ali su i pouzdaniji. Neki od ovih testova detektuju ukupna antitela, tj. nema razlikovanja IgM i IgG.